历年来外泌体一直都是申请国自然炙手可热的明星。

自从 2013 年美国科学家詹姆斯和兰迪以及德国科学家托马斯发现囊泡运输调控机制获得诺贝尔生物学或医学奖后，外泌体便平步青云、飞速发展。

国自然资助项目数量更是大幅增加，涉及到肿瘤、心脑血管、神经、免疫系统疾病等各个领域，随随便便便是 CNS 及其子刊的座上宾。

今天，科研哥便邀请外泌体本体为我们解读他的成名史。

各位科研论文时间的老铁们，大家好，我叫外泌体（Exosomes），感谢科研哥的邀请，来和大家伙唠唠。

其实吧，我就是细胞分泌的粒径在 30～140 nm 具有脂质双分子层结构的纳米级囊泡，别看我肚子不大，里面可都是丰富的蛋白质、脂质和核酸。

我平常吧，主要在血液、尿液、脑脊液、唾液、乳汁、胆汁等各种体液中呆着，没事也溜达，日常的工作主要是细胞间通讯、物质传递和免疫互作，你们可别看我的个头小，有老话不是说，个头虽小，浑身是宝。

目前你们人类治不好的疾病未来都有可能通过我和我的兄弟姐妹们早期发现，当然我也可以指导大夫的临床用药及预后。

不怕大伙笑话，我可是典型的 80 后，1983 年首次在绵羊网织红细胞中出生，时至今日，提取的方法很多，像差速离心、密度梯度离心、PEG-base 沉淀法、试剂盒提取等等，成功提取是保证你们能见到我的第一步。

鉴于时间有限，方法就不一一展开了，大家感兴趣自己查询，当然两种或两种以上分离技术的联合应用可能是更优化的策略。

二、聚是一团火，散作漫天星

我和我的兄弟姐妹们被提取出来后，对于素未谋面的你我，第一步是需要证明我是我！我不像在座各位有身份证，只能通过其他手段来鉴定——需要从表征到膜表面标志物进行多维度的鉴定，举几个例子：

1. NTA 粒径分析

前面说过，我个头在 30～140 nm 之间，可以利用纳米颗粒示踪分析—— NTA（Nanoparticle Tracking Analysis）可快速、稳定地进行外泌体的粒径与浓度和纯度的鉴定。NTA 是基于单一颗粒示踪技术并结合经典微电泳技术（Zeta 电位）和布朗运动，利用 Stockes-Einstein 方程式同时能够计算出我们纳米颗粒的流体力学直径和浓度。

2. TEM 透射电镜鉴定

哈哈哈，讲这么多，大家很期待我的「照骗」吧，我的芳容只有在分辨率为 0.1～0.2 nm 透射电镜 TEM（Transmission Electron Microscope）下超微显现，我和我兄弟姐妹通常犹抱琵琶半遮面，呈现茶托型或一侧凹陷的半球形。

3. Western Blot 检测

当然，也可以通过常用生物学 Western Blot 检测我们表面的标志蛋白，对纯度进行进一步鉴定。

常见的有如 tetraspanins 蛋白超家族（CD63、CD9、CD81 和 CD82）、热休克蛋白 HSP70（heat shock protein 70）和肿瘤易感基因 TSG101（tumor susceptibility gene 101）等等，这些可以作为阳性对照。

根据外泌体相关文献的统计，排在前 4 位的检测指标为 CD63、Tsg101、 CD9 和 CD81；接着检测较多的 4 个指标为 Alix、 HSP70、 flotillin，同时把大伙可以把内质网上特异性分子 Calnexin 作为阴性对照，建议选择三阳一阴。

三、三大研究思路

既然认识了我们兄弟姐妹了，该说说我们的国自然热点应用了，啧啧啧，那可谓散作满天星，各显神通。我们主要有三大研究思路：新型分子标志物、结合各种组学技术的分子机制和靶向给药治疗。

1. 新型的 Biomarkers 标志物

因为我们可以穿过内皮进入循环系统，几乎在所有的体液中都有我们的身影，因此我们携带的相关蛋白、miRNA 以及 LncRNAs 等有作为个性化检测和筛查 Biomarkers 的潜质，也是液体活检的重要组成部分，这可是真正造福人类的早期筛查。

2. 结合高通量测序的分子机制

结合之前火热的各种组学技术来揭示我们体内携带各种 RNA 分子对细胞、组织甚至疾病的影响，从分子水平探究产生现象的机制，我们兄弟姐妹将各种组学进一步横向扩展，自然很受国自然专家的赏识。

3. 靶向给药治疗

正如前面讲的，一我们在动植物体内普遍存在，二表面携带有特异性标志可以作为临床中肿瘤诊断、治疗、肿瘤进展和预后评估的新靶点，能够开辟独特的思路和方法；

同时随着各种纳米载药技术、基因工程技术兴起以及 PD-1/PD-L1 抑制剂在临床上应用广泛，恰逢我们又具有高生物相容性、低免疫原性和易于修饰等特征，作为不同靶向载体修饰进行药物递送的同时又可以进行免疫治疗。

可谓一箭多雕，这些大大打响了我们的名声，在各种疾病中具有广阔的应用前景。

四、题好一半文，磨刀不误砍柴工

唠不少了，各位有点累了吧，只要大家按照刚才说的三个大方向准备国自然，就成功一大半了。作为国自然的宠儿，最后顺便教大家几招申请国自然的技巧吧。

1. 拟一个好的标题，题好一半文

申请标题中尽量要避免使用过于宽泛的词汇，如组学、非靶向、机制研究等，最好聚焦，缩小范围在研究的具体目的上，比如「A 通过干预 B 信号在 C 方面对 D 疾病的影响」等。

2. 能否中标，几百字的摘要作用尤为重大

一定要高度浓缩、精炼语言、英文地道，尽力突出创新点，毕竟整个评审时间可能就是你们摘要被阅读完的时间。

3. 注重细节，磨刀不误砍柴工

申请书里各种格式一定要严格按照基金委给的条条框框来写，毕竟每年约有 2% 的标书因为格式被刷。

另外谨防错别字、中式英文等不太高级的错误，当然低级错误更是致命的，比如申请代码选择错误、依托单位不一致、申请人和参与人的资格问题等。

若这些细节出错，你磨好的刀还为未鞘可能已经败下阵来，可对得起你完美的课题设计和洋洋洒洒的万言标书？

参考资料：

1. Sequential phosphoproteomics and N-glycoproteomics of plasma-derived extracellular vesicles. Nature Protocols, 2019.

2. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science,2020.

3. Small extracellular vesicles have gst activity and ameliorate senescence-related tissue damage. Cell Metabolism, 2020.

4. Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers. Cell, 2020.

5. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature,2015.

6. Protein Profiling and Sizing of Extracellular Vesicles from Colorectal Cancer Patients via  Flow Cytometry. ACS Nano,2018.